Cell | 中国学者揭示小儿肠炎的“罪魁祸首”——环状AMP（cAMP）信号受损

撰文 | 雪月

根据欧洲儿科胃肠病学肝病学和营养学会European Society for Paediatric Gastroenterology Hepatology and Nutrition (ESPGHAN)定义，小儿（<17岁）发作的肠炎为小儿肠炎（pediatric IBD，PIBD）【1】。但是小儿肠炎的症状与经典的Crohn’s disease（CD）和ulcerative colitis（UC）不太一样。肠镜检测中的大体形态、侵袭程度以及发病时长都略有不同，分类更加细致。近几十年来PIBD在全球范围内呈现增长趋势。主要原因是由于环境的改变对携带IBD风险基因的机体造成了较大的影响，增加了致病几率。尤其对于小于六岁的儿童风险基因往往成为致病原因。在成人IBD（inflammatory bowel disease，炎症性肠病）中发挥重要作用的上皮间免疫细胞包括T/B细胞、ILCs、巨噬细胞和树突状细胞以及粒细胞在PIBD中会呈现什么样的变化以及风险基因造成的影响都亟待更深入的研究。

2019年11月14日，来自广州医科大学/广州市妇女儿童医疗中心张玉霞、杨敏、龚四堂等与北京大学白凡课题组合作在Cell上发表了题为“Mucosal Profiling of Pediatric-Onset Colitis and IBD Reveals a Common Pathogenesis and Therapeutic Pathway”的文章。该文章运用单细胞分析技术探究了PIBD免疫表型，风险基因对疾病的影响。作者发现各个类型的PIBD都存在环状AMP（cAMP）信号受损。作者还发现表达PDE4B和TNF巨噬细胞的浸润会显著的降低上皮间T细胞的数量和血小板聚集以及5-羟色胺的释放。作者发现给予磷酸二酯酶抑制剂dipyridamole则能够恢复肠道免疫稳态，缓解肠炎症状。

作者首先收集了从2016年10月到2019年4月之间进行肠镜检查的306名儿童的样本。根据形态和组织学将处于静息期的94例作为对照组，40例CD，6例UC，5例未分类IBD。剩下的161例样本根据病理和组织评分被定义为轻度（1级）或中度/重度（2-3级）未分化结肠炎。

作者对其中的对照 (n = 6)、colitis (n = 6)、UC (n = 2)和CD (n = 3)样本中的CD45阳性（免疫细胞）和CD45阴性（非免疫细胞）进行单细胞RNA-sequencing分析，并对免疫细胞进行了单细胞V(D)J enrichment分析。经过数据分析和质量控制，最终65367个免疫细胞和7798个非免疫细胞成功获得转录组数据。分析之后这些细胞被分为9组：B cell、plasma、T＆NK cell、lymphoid-tissue-inducer cell、 Mitotic B cell、 Mitotic T cell、Fibroblast&Endothelium、 Epithelium。运用GWAS分析发现了244个基因与PIBD患病风险有关。

作者总共分析了6960个上皮细胞，并把它们分为10个亚型。作者分析和列举了一些风险基因在上皮细胞亚型中的定位，发现不同风险基因的表达特异性较高，分别表达在干细胞、tuft细胞或者分泌型前体细胞、肠内分泌细胞中，与上皮完整性破坏和细胞应激反应密切相关。

作者将成纤维细胞分为7个亚型。作者分析列举了成纤维细胞亚型中特异性的与PIBD相关的基因。其中WNT2B高表达的和炎症型成纤维细胞主要参与TNF、NF-κB和应激信号通路。炎症型的成纤维细胞也高表达细胞外基质重塑相关基因。分析内皮细胞则发现在PIBD患者中内皮细胞会上调血管生成和白细胞外渗相关基因。促进调节性T细胞分化的IL33也在内皮细胞中高表达。

接下来分析髓系来源的细胞发现，髓系来源的细胞在PIBD患者样本中数量较多，所有细胞都表达CD68，并被分为十个群体。其中4群表达CD14被定为巨噬细胞，5群被定为树突状细胞，另外一群是肥大细胞。macrophage-IL1B^hi/TNF⁺、macrophage^-S100A8^hiIL1B^hi/TNF⁺和 DC-IL1B^hi细胞在对照组样本中未有分布。进一步分析发现在TNF高表达的巨噬细胞中PDE4B表达量也明显提升。PED4B会降低细胞中cAMP的含量【2】。应用临床药物PDE抑制剂dipyridamole处理PBMC会降低LPS诱导的炎症因子的表达，上调细胞内cAMP含量。

之后分析其他种类的免疫细胞。分析总共发现了7种CD19阳性的B细胞亚型，2种浆细胞以及16种T＆NK细胞和亚型特异性的转录因子。作者发现CD39-阳性的 CD8Trm和γδT 细胞在PIBD患者肠道组织丰度中显著降低。CD39是一种膜结合的核苷酸酶，通过降解细胞外过量的ATP和ADP为AMP维持免疫稳态。CD39多表达在慢性病毒感染和肿瘤中的耗竭T细胞中【3】。

进一步探究作者发现细胞中CD39的表达与黏膜组织中ADP含量呈负相关。ADP是血小板激动剂，促进血小板累积和5-羟色胺分泌。在样本检测中也发现ADP和5-羟色胺呈正相关。在PIBD患者分离得到的血小板中能够分泌更高浓度的5-羟色胺。上皮细胞间CD39阳性的T细胞的不足会通过促进血小板聚集和5-羟色胺释放而加剧肠炎疾病程度。

综上，PIBD患者肠道组织会浸润高炎症水平的巨噬细胞和树突状细胞，CD39阳性的IET数量降低，血小板聚集明显。这些一系列的表型的成因或许都是cAMP含量以及反应通路的降低。利用PDE抑制剂dipyridamole进行体内实验发现，dipyridamole能够显著提高小鼠体重，降低疾病严重程度，降低血小板聚集和TNF-α的表达，升高肠道黏膜组织中cAMP含量，并减少ADP浓度。dipyridamole是一种使用于儿童的抗血小板且安全性较好的药物。于是作者进行了8例患者的临床实验，并获得了与在小鼠体内实验一致的效果。作者接下来分析了两种治疗PIBD的传统方法：糖皮质激素治疗和抗TNF-α治疗。作者发现糖皮质激素能够抑制血小板聚集，却不能改变TNF-α和CD39的表达。抗TNF-α药物能够改善疾病状况，对免疫细胞和血小板影响较小。或许是因为抗抗TNF-α药物靶向TNF-α下游信号。这些都表明靶向cAMP或许能显著提升疾病相关的多种免疫相关的因素，增强治疗效果，也可能能够应用于成人IBD治疗。这篇文章也树立一个榜样，将单细胞技术应用大放异彩，并展示了怎样深入分析疾病中的细胞和分子能够很好的揭示疾病的发病机制以达到治疗的目标。

原文链接：

https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.027

参考文献

1. Levine A, Koletzko S, Turner D, Escher JC, Cucchiara S, de Ridder L et al. ESPGHAN revised porto criteria for the diagnosis of inflammatory bowel disease in children and adolescents. Journal of pediatric gastroenterology and nutrition 2014; 58(6): 795-806; doi 10.1097/MPG.0000000000000239.

2. Gresele P, Momi S, Falcinelli E. Anti-platelet therapy: phosphodiesterase inhibitors. British journal of clinical pharmacology 2011; 72(4): 634-646; doi 10.1111/j.1365-2125.2011.04034.x.

3. Canale FP, Ramello MC, Nunez N, Araujo Furlan CL, Bossio SN, Gorosito Serran M et al. CD39 Expression Defines Cell Exhaustion in Tumor-Infiltrating CD8(+) T Cells. Cancer research 2018; 78(1): 115-128; doi 10.1158/0008-5472.CAN-16-2684.